去內(nèi)毒素試劑盒
使用說(shuō)明書(shū)
僅供體外研究使用，不用于臨床診斷!
第1版（2016年04月修訂）
關(guān)聯(lián)信息
細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的特有成份，它是一種外源性致熱原，可通過(guò)激活巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等引起炎性介質(zhì)的釋放，導(dǎo)致機(jī)體的損傷，嚴(yán)重者可引發(fā)膿毒性休克甚至死亡。而內(nèi)毒素又是生物制品的重要污染物，所以，對(duì)于直接進(jìn)入人體或者動(dòng)物體內(nèi)的生物制品、藥品都必須嚴(yán)格控制其內(nèi)毒素含量。因此，內(nèi)毒素的去除對(duì)于一些生物制品的下游純化處理來(lái)說(shuō)就顯得非常重要。
原理
多粘菌素（Polymyxin）是由多粘芽胞桿菌（Bacilluspolymyxa）產(chǎn)生的一組多肽類抗生素。其中，多粘菌素B（PMB）能拮抗細(xì)菌內(nèi)毒素，雖然他們的結(jié)合機(jī)理還存在很多爭(zhēng)議，但是它們之間是通過(guò)靜電作用，離子作用和親水作用等多種因素共同作用的結(jié)果是大家普遍接受的事實(shí)。本試劑盒基于這一原理利用親和樹(shù)脂中的多粘菌素B與內(nèi)毒素特異性的結(jié)合去除樣品中的內(nèi)毒素。親和樹(shù)脂的主要特性如下表：
| 規(guī)格 | 1.5 ml 預(yù)裝柱 |
| 結(jié)合能力 | ≤2,000,000 EU/ml 樹(shù)脂 |
| 配基 | 修飾的多粘菌素 B (PMB) |
| pH范圍 | pH 5-10 |
| 基質(zhì) | 4% 交聯(lián)的瓊脂糖凝膠 |
| 顆粒大小 | 90 μm |
| 保存溫度 | 2°C-8°C |
| 使用壽命 | 18 個(gè)月 |
| 平衡緩沖液 | 磷酸鹽緩沖液，pH 8.0 |
| 離子條件 | 0.1-0.5 M NaCl |
| 可耐受試劑 | 20% DMSO,，20% 乙醇，20% 甘油，1 M 尿素，300 mM 咪唑， 0.05% 吐溫-20， 10 mM DTT 等 |
產(chǎn)品組分
| 名稱 | 規(guī)格 |
| 親和樹(shù)脂 | 1.5 ml 預(yù)裝柱 |
| 再生緩沖液 | 250 ml |
| 平衡緩沖液 | 250 ml |
| 流速控制器 | 1 個(gè) |
| 無(wú)熱原接收管 | 1 包 （3 支/包） |
| 無(wú)熱原槍頭（1 ml） | 2 包（6 支/包） |
| 說(shuō)明書(shū) | 1 份 |
*親和樹(shù)脂重復(fù)使用5次不改變結(jié)合效率
還需準(zhǔn)備的設(shè)備和試劑
1. 純化柱支架
2. 0.1M NaOH和0.1M HCl，用于調(diào)節(jié)樣品PH值
3. 氯化鈉和乙醇
儲(chǔ)存及有效期
4℃保存，有效期一年。
適用范圍
蛋白，多肽，抗體，多糖等溶液中內(nèi)毒素的去除，樣品最終的內(nèi)毒素水平可低于0.1 EU/ml。
操作步驟
1. 樣品處理：結(jié)合內(nèi)毒素的pH范圍為5-10，pH范圍7-8進(jìn)行純化最佳。樣品在0.15-0.5M NaCl的條件可以明顯增強(qiáng)特異性吸附并降低非特異性吸附。純化之前可以使用無(wú)內(nèi)毒素的5M氯化鈉、0.1 M NaOH或0.1M HCl來(lái)調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度或PH值。
2. 活化樹(shù)脂：垂直裝配好預(yù)裝柱，去除頂部蓋子，打開(kāi)流速控制器，使保護(hù)液流干。加入5ml再生緩沖液，調(diào)節(jié)流速控制器，保持流速在0.25ml/min（或10滴/min），待再生緩沖液流干后再加入5ml再生緩沖液，重復(fù)操作2次，以確保體系中無(wú)熱源（即內(nèi)毒素）存在。（注意：第一次使用也必須進(jìn)行本步驟。）
3. 平衡樹(shù)脂：加入6ml的平衡緩沖液，調(diào)節(jié)流速控制器，保持流速在0.5ml/min，流干平衡緩沖液，再按此操作重復(fù)2次。
4. 內(nèi)毒素去除：將流速控制器關(guān)閉，使用無(wú)熱源槍頭加入樣品，打開(kāi)控制器，控制流速不高于0.25ml/min，流出液體積達(dá)到1.5ml后，使用無(wú)熱源接收管收集樣品。待樣品流干后，再加入1.5ml-3.0ml的平衡緩沖液淋洗，收集淋洗液。檢測(cè)樣品濃度及所含內(nèi)毒素水平。（如果流出樣品內(nèi)毒素水平未能達(dá)到預(yù)期值，需要將預(yù)裝柱按照步驟2重新再生，然后上樣純化。）
5. 柱保存：預(yù)裝柱用完后，先用10ml平衡緩沖液平衡柱，待平衡液流干，加入1.5ml的再生緩沖液（含0.02%的疊氮化鈉），2℃‐8℃保存。
注意事項(xiàng)
1. 在使用本產(chǎn)品過(guò)程，請(qǐng)嚴(yán)格控制操作環(huán)境，防止外來(lái)內(nèi)毒素污染純化過(guò)的樣品。
2. 試劑盒內(nèi)物內(nèi)毒素槍頭盒收集管開(kāi)封后，一次性用完。
3. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
問(wèn)題及解決方法
| 問(wèn)題 | 問(wèn)題原因 | 解決方法 |
| 去除效率低 | 樣品的pH值過(guò)高或者過(guò)低，不在最適范圍 | 調(diào)節(jié)pH至7-8 |
| 樣品和親和樹(shù)脂孵育時(shí)間太短 | 降低樣品的流速，或者通過(guò)低溫孵育來(lái)解決 | |
| 去除或檢測(cè)系統(tǒng)受到外來(lái)因素污染 | 使用無(wú)熱源的實(shí)驗(yàn)儀器，保證體系不受污染 | |
| 內(nèi)毒素與目的蛋白結(jié)合太牢固 | 1. 優(yōu)化樣品的pH，使它們解離 2. 增加接觸樣品與親和樹(shù)脂的時(shí)間 | |
| 樣品損失高 | 樣品通過(guò)非特異性作用結(jié)合在親和樹(shù)脂上 | 增加樣品和平衡緩沖液中NaCl的含量 |
| 目的蛋白與內(nèi)毒素結(jié)合牢固 | 1. 優(yōu)化樣品的pH，使內(nèi)毒素解離出來(lái) 2. 增加接觸樣品與親和樹(shù)脂的時(shí)間 | |
| 樣品被污染 | 同一根柱子處理不同的樣品 | 盡量避免使用同一個(gè)預(yù)裝柱處理不同樣品。 如果無(wú)法避免，可以在處理一個(gè)樣品之后，用10-20 ml 2M NaCl淋洗樹(shù)脂，然后再處理另外一 種樣品 |
| 再生緩沖液出現(xiàn)渾濁 | 當(dāng)再生緩沖液達(dá)到室溫時(shí)將會(huì)出現(xiàn)渾濁 | 使用之前在冰上冷卻再生緩沖液或者在4℃條件下進(jìn)行再生 |
