MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒
使用說明書
僅供體外研究使用，不用于臨床診斷!
第1版（2016年04月修訂）
???[關(guān)聯(lián)信息]
?? 細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒理檢測實(shí)驗(yàn)，被廣泛應(yīng)用于評(píng)估一些影響細(xì)胞周期的因子，如：生長因子.細(xì)胞因子.有絲分裂原以及影響細(xì)胞分裂和增殖的藥物等，成為在醫(yī)學(xué)檢測、藥物檢測以及食品和環(huán)境安全檢測中的一個(gè)重要手段。??
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[基本原理]
?? 噻唑蘭（Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, MTT），是一種可接受氫離子的化合物染料，帶正電荷，具有很強(qiáng)的細(xì)胞膜滲透性。當(dāng)MTT進(jìn)入活細(xì)胞中后，線粒體中的琥珀酸脫氫酶將MTT還原成深藍(lán)色的MTT-甲臜結(jié)晶。甲臜結(jié)晶不具有細(xì)胞膜滲透性，將會(huì)被永久的保留在活細(xì)胞內(nèi)，使活細(xì)胞著色。而死細(xì)胞一方面細(xì)胞膜被破壞不具有選擇透過性，另一方面不具有將MTT還原形成MTT-甲臜結(jié)晶的能力，將不會(huì)被著色。甲臜結(jié)晶在570nm波長處具有最高吸收峰，通過酶標(biāo)儀檢測??OD570nm，??便能很好的反應(yīng)體系中甲臜的生成量。而甲臜的生成量與活細(xì)胞數(shù)目成正比，用以評(píng)估細(xì)胞存活和增值狀況。??
[產(chǎn)品組分] ??
規(guī)格?? | ??1000次?? | |||
???試劑A：MTT（粉末）?? | ??50 mg?? | |||
??試劑B：MTT溶解液?? | ??12 ml?? | |||
??試劑C：甲臜溶解液?? | ??120 ml?? | |||
??說明書?? | ??1份?? | |||
[保存條件和有效期]
試劑A和試劑B需避光-20℃保存，試劑C放置于4℃保存。未開封試劑，有效期12個(gè)月。???
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[使用方法]
A．實(shí)驗(yàn)前試劑準(zhǔn)備
??1. MTT溶液配置
?? 用5ml MTT溶解液直接溶解25mg MTT粉末配制成5mg/ml的工作液，過濾除菌，該溶液可4℃ 避光短時(shí)間保存（越短越好）。建議溶解后，直接將剩余液體小劑量分裝放到-20℃保存，能穩(wěn)定保存3-6個(gè)月，避免反復(fù)凍融。??
??2. 甲臜溶解液??
甲臜溶解液低溫或者常溫保存可能會(huì)產(chǎn)生沉淀，只需37℃水浴使其充分溶解，混勻后即可使用。?????
B．MTT細(xì)胞增殖檢測
??1. 接種細(xì)胞：用含10%胎牛血清（FBS）的培養(yǎng)液配制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度，以每孔??5×103~2×104個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積100μl，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基+MTT+甲臜溶解液），對(duì)照孔（細(xì)胞+相同濃度的藥物溶解介質(zhì)+培養(yǎng)液+MTT+ 甲臜溶解液）。
??2. 37℃，5% CO2，培養(yǎng)24-72h。??
??3. 可選：對(duì)于貼壁細(xì)胞，去除舊的培養(yǎng)液，更換100μl/孔新鮮的培養(yǎng)液（不含酚紅）；對(duì)于懸浮細(xì)胞，離心96孔板，去除盡可能多的上清液。然后加入100μl/孔新鮮的培養(yǎng)液（不含酚紅）重懸細(xì)胞。??
??4. 每孔加入10μl MTT工作液（5mg/ml）。??
??5. 水平搖床上低速混勻1min后，放入37℃培養(yǎng)箱孵育4h。注：對(duì)于高密度的細(xì)胞（>100,000 個(gè)/孔）可縮短孵育時(shí)間至2h。??
??6. 對(duì)于貼壁細(xì)胞，直接吸掉舊的培養(yǎng)液，避免槍尖刮破單細(xì)胞層。對(duì)于懸浮細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，去除培養(yǎng)液。??
??7. 加入100μl/孔甲臜溶解液，用槍充分混勻后放入37℃培養(yǎng)箱孵育4 h。??
??8. 孵育結(jié)束，放置在酶標(biāo)儀上搖勻后，選擇570nm，測定吸光度。????
[注意事項(xiàng)]
??1. MTT溶液對(duì)溫度.光照和有菌環(huán)境比較敏感，較長時(shí)間保存需低溫、遮光并在無菌條件下保存。當(dāng)溶液顏色變?yōu)榛揖G色請(qǐng)勿使用。??
??2. MTT溶液在低溫下會(huì)凝固，請(qǐng)置于室溫或20~25℃，直到溶液全部溶解并混勻后使用。??
??3. 如使用96T板長時(shí)間進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和檢測，為防止液體蒸發(fā)給檢測結(jié)果帶來的不穩(wěn)定性，可在培養(yǎng)板的邊緣孔用無菌PBS，水或者培養(yǎng)液填充。??
??4. 在細(xì)胞培養(yǎng)板孔中加入甲臜溶解液后，在普通光學(xué)顯微鏡下注意觀察甲臜的溶解情況，當(dāng)甲臜正好全部溶解時(shí)進(jìn)行OD570nm的檢測最為準(zhǔn)確，長時(shí)間的孵育將降低檢測的靈敏度。通常37℃孵育4小時(shí)左右，紫色結(jié)晶會(huì)全部溶解。如果紫色結(jié)晶較小較少，溶解的時(shí)間會(huì)短一些。如果紫色結(jié)晶較大較多，溶解的時(shí)間會(huì)長一些。??
??5. MTT溶液具有弱毒性，甲臜溶解液具有腐蝕性，為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套按照實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作手冊(cè)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。??
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