CCK-8試劑盒

使用說(shuō)明書(shū)

僅供體外研究使用，不用于臨床診斷!

第1版（2016年04月修訂）

[產(chǎn)品信息]

WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物，生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。CCK-8試劑盒是一款基于WST-8顯色為基本原理，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速、高靈敏度檢測(cè)試劑盒。

[試劑組分]

組分	IS087-1（100次裝）	IS087-2（200次裝）	IS087-3（500次裝）
CCK8溶液	1ml	2ml	5ml
使用說(shuō)明書(shū)	一份

[適用范圍]

藥物篩選、細(xì)胞增殖測(cè)定、細(xì)胞毒性測(cè)定、腫瘤藥敏試驗(yàn)。

[儲(chǔ)存及有效期]

-20℃避光保存，一年有效。

[實(shí)驗(yàn)操作]

1. 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞制備成一定濃度的細(xì)胞懸液，每孔100ul加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，在培養(yǎng)孔中加入0-10ul待測(cè)的藥物繼續(xù)培養(yǎng)。

2. 將試劑盒中的CCK-8溶液取10ul加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育0.5-4小時(shí)。

3. 在450nm測(cè)定吸光度。建議采用雙波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)波長(zhǎng)430-490nm，參比波長(zhǎng)600-650nm。

[注意事項(xiàng)]

1. 通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入2000個(gè)/100ul 細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入5000/100ul 個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小、細(xì)胞增殖速度的快慢等因素決定)。

2. 如果是貼壁細(xì)胞，需要37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)2-4小時(shí)等細(xì)胞貼壁后再開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，如果是懸浮細(xì)胞，不需要預(yù)培養(yǎng)。

3. 如果是做細(xì)胞毒性試驗(yàn)，加入毒性物質(zhì)后的培養(yǎng)時(shí)間需要摸索。要看毒性物質(zhì)的性質(zhì)和細(xì)胞的敏感性，一般要根據(jù)細(xì)胞周期來(lái)決定，起碼要一代以上的時(shí)間。

4. 如果細(xì)胞起始的培養(yǎng)體積為200ul，則需加入20ul的CCK-8溶液，其它情況以此類(lèi)推。

5. 建議每個(gè)藥物濃度孔設(shè)置3個(gè)復(fù)制孔，最后取均值做曲線。

6. 設(shè)計(jì)好實(shí)驗(yàn)對(duì)照，盡量排除其它因素的干擾：1）空白對(duì)照：可以用加了等量細(xì)胞培養(yǎng)液、CCK-8溶液和藥物但沒(méi)有加細(xì)胞的孔；2）陰性對(duì)照：不加藥物但加了藥物溶劑的細(xì)胞孔。

7. 本試劑盒的檢測(cè)依賴(lài)于脫氫酶催化的反應(yīng)，如果待測(cè)物質(zhì)有氧化性或還原性，可能會(huì)干擾檢測(cè)，需設(shè)法去除（加入CCK-8溶液之前更換新鮮培養(yǎng)基，去掉藥物影響。如果藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可）。

8. 加入CCK-8溶液后注意孵育時(shí)間。對(duì)于大多數(shù)情況孵育1小時(shí)就可以了。時(shí)間的長(zhǎng)短根據(jù)細(xì)胞的類(lèi)型和細(xì)胞的密度等實(shí)驗(yàn)情況而定，初次實(shí)驗(yàn)時(shí)可以在0.5、1、2和4小時(shí)后分別用酶標(biāo)儀檢測(cè)，然后選取吸光度范圍比較適宜的一個(gè)時(shí)間點(diǎn)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

9. 當(dāng)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)，由于體積不準(zhǔn)確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔只加培養(yǎng)基，不作為測(cè)定孔用。

10. 若暫時(shí)不測(cè)定OD值，可以向每孔中加入10ul 10% SDS溶液終止反應(yīng)，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時(shí)內(nèi)測(cè)定，吸光度不會(huì)變化太大，一般還是建議立刻檢測(cè)。

11. 用酶標(biāo)儀檢測(cè)前需確保每個(gè)孔內(nèi)沒(méi)有氣泡，否則會(huì)干擾測(cè)定。